Post-modern bioethical stresses destination of surplus embryos: Brazilian analysis and brief comparisons

The objective of the present study is to point out tensions of the theoretical/practical universe that Bioethics is facing in Brazil, in the search for a praxis for the destination of surplus embryos. We consider that Bioethics analyzes the implications of such practices in society and in relationships between individuals. Brief data from other countries were presented to compare the Brazilian situation progressively from the conceptual point of view and the adoption of measures. The research is a scoping review on the main points that have been hindering the progress of discussions on the subject and consequently the respective solution. The legal status of the embryo was described from several perspectives and theories, with the resulting proposals for the destination of surplus embryos in their positive and negative aspects. The tensions of Bioethics were presented in the context of post-modernity and the consequent social and moral plurality, together with the difficulties of identifying a secular bioethical morality. In the end, we conclude the possibility of proclaiming a consensus on the destination of surplus embryos based on secular morality, supported by the figure of the "moral strangers".

El objetivo del presente estudio es señalar las tensiones del universo teórico/práctico que la bioética enfrenta en Brasil, en la búsqueda de una praxis para el destino de los embriones sobrantes. Consideramos que la bioética analiza las implicaciones de tales prácticas en la sociedad y en las relaciones entre los individuos. Se presentaron breves datos de otros países para comparar progresivamente la situación brasileña desde el punto de vista conceptual y de la adopción de medidas. La investigación es una revisión del alcance de los principales puntos que han obstaculizado el avance de las discusiones sobre el tema y, en consecuencia, la respectiva solución. Se describió el estatuto jurídico del embrión desde diversas perspectivas y teorías, con las consiguientes propuestas para el destino de los embriones sobrantes en sus aspectos positivos y negativos. Se presentaron las tensiones de la bioética en el contexto de la posmodernidad y la consecuente pluralidad social y moral, junto con las dificultades de identificar una moral bioética laica. Al final, se concluye la posibilidad de proclamar un consenso sobre el destino de los embriones sobrantes basado en una moral laica, apoyada en la figura de los "extraños morales".

O objetivo do presente estudo é destacar as tensões do universo teórico/prático que a Bioética está enfrentando no Brasil, na busca de uma praxis para a destinação de embriões excedentes. Nós consideramos que a Bioética analisa as implicações de tais práticas na sociedade e nas relações entre indivíduos. Dados resumidos de outros países são apresentados para comparar a situação brasileira progressivamente de um ponto de vista conceitual para a adoção de medidas. A pesquisa é uma revisão de escopo sobre os pontos principais que vem atrapalhando o andamento das discussões sobre o assunto e consequentemente a solução respectiva. O status legal do embrião foi descrito a partir de diversas perspectivas e teorias, com as propostas resultantes para a destinação dos embriões excedentes em seus aspectos positivos e negativos. As tensões da Bioética foram apresentadas no contexto da pós-modernidade e a consequente pluralidade social e moral, juntamente com as dificuldades de identificar uma moralidade bioética secular. Ao final, nós concluímos pela possibilidade de proclamar um consenso sobre a destinação de embriões excedentes baseado na moralidade secular, apoiado pela figura dos "estranhos morais".

Análisis bioético (subjetivismo moral) desde la percepción de los clínicos sobre la situación de los embriones sometidos a fecundación in vitro. Quito-Ecuador / Bioethical analysis (moral subjectivism) from the perception of clinicians on the situation of embryos subjected to in vitro fertilization. Quito-Ecuador / Análise bioética (subjetivismo moral) a partir da percepção dos médicos sobre a situação dos embriões submetidos à fertilização in vitro. Quito-Equador

Resumen: Objetivo. Analizar las percepciones y prácticas de los clínicos en relación con el manejo del embrión sometido a técnicas de fecundación in vitro. Metodología. Cualitativa (subjetivista y fenomenológico). Se realizaron 15 las entrevistas semiestructuradas aplicando un muestreo por saturación dirigidas a personal clínico que haya participado en procedimientos de fecundación in vitro. Los datos se analizaron con el programa Atlas Ti 8.0®. Resultado. Los clínicos consideran al embrión como un ser humano o futuro ser humano y, además, merecedor de respeto y consideración, proponiendo incluso mejoras en los procesos de manipulación y almacenaje. Conclusión. Los embriones no son considerados como entes susceptibles de recibir daño, desde argumentos no solo técnicos sino éticos. Desde la corriente principialista, se describe la necesidad de promover actitudes de responsabilidad y prudencia para evitar el dogmatismo (objetivismo moral) proponiendo una postura deliberativa.

Abstract: The objective of this paper is to analyze the perceptions and practices of clinicians in relation to the management of embryos subjected to in vitro fertilization techniques. Methodology is Qualitative (subjectivist and phenomenological). A total of 15 semi-structured interviews were conducted using saturation sampling for clinical personnel who have participated in vitro fertilization procedures. The data is analyzed with the Atlas Ti 8.0® program. Results: Clinicians consider the embryo as a Human being or future human being, in addition, deserving of respect and consideration even proposing improvements in the processes of handling and storage. Conclusion. Embryos are not considered as entities susceptible of damage from not only technical but ethical arguments. From the principialist current, the need to promote attitudes of responsibility and prudence to avoid dogmatism (moral objectivism) is described, proposing a deliberative position.

Resumo: Objetivo. Analisar as percepções e práticas dos médicos em relação ao manejo do embrião submetido a técnicas de fertilização in vitro. Metodologia. Qualitativo (subjetivo e fenomenológico). Foram realizadas 15 entrevistas semiestruturadas por amostragem de saturação para pessoal clínico que participou de procedimentos de fertilização in vitro. Os dados são analisados com o programa Atlas Ti 8.0®. Resultado. Os médicos consideram o embrião como um ser humano ou futuro, além de merecer respeito e consideração, propondo até melhorias nos processos de manuseio e armazenamento. Conclusão. Os embriões não são considerados como entidades suscetíveis a receber danos não apenas de argumentos técnicos, mas éticos. A partir da corrente principialista, descreve-se a necessidade de promover atitudes de responsabilidade e prudência para evitar o dogmatismo (objetivismo moral), propondo uma posição deliberativa.

The Addition of Dydrogesterone after Frozen Embryo Transfer in Hormonal Substituted Cycles with Low Progesterone Levels / Uso adicional de didrogesterona após transferência de blastocisto em ciclos substituídos com valores baixos de progesterona

Abstract Objective To determine whether a rescue strategy using dydrogesterone (DYD) could improve the outcomes of frozen embryo transfer cycles (FET) with low progesterone (P4) levels on the day of a blastocyst transfer. Methods Retrospective cohort study including FET cycles performed between July 2019 and October 2020 following an artificial endometrial preparation cycle using estradiol valerate and micronized vaginal P4 (400 mg twice daily). Whenever the serum P4 value was below 10 ng/mL on the morning of the planned transfer, DYD 10 mg three times a day was added as supplementation. The primary endpoint was ongoing pregnancy beyond 10 weeks. The sample was subdivided into two groups according to serum P4 on the day of FET: low (< 10 ng/mL, with DYD supplementation) or normal (above 10 ng/mL). We performed linear or logistic generalized estimating equations (GEE), as appropriate. Results We analyzed 304 FET cycles from 241 couples, 11.8% (n = 36) of which had serum P4 below 10 ng/mL on the FET day. Baseline clinical data of patients was comparable between the study groups. Overall, 191 cycles (62.8%) had a biochemical pregnancy, of which 131 (44,1%) were ongoing pregnancies, with a 29,8% miscarriage rate. We found no statistically significant differences in the hCG positive (63 vs 64%) or ongoing pregnancy rates (50 vs 43,3%) between those FETs with low or normal serum P4 values, even after multivariable logistic regression modelling. Conclusion Our results indicate that DYD 10 mg three times a day administered in women who perform FET with P4 serum levels < 10 ng/mL, allows this group to have pregnancy rates beyond 12 weeks at least as good as those with serum levels above 10 ng/mL.

Resumo Objetivo Determinar se uma estratégia de resgate usando didrogesterona (DYD) pode melhorar os resultados dos ciclos de transferência de embriões congelados (TEC) com baixos níveis de progesterona (P4) no dia de uma transferência de blastocisto. Métodos Estudo de coorte retrospectivo que incluiu ciclos TEC realizados entre julho de 2019 e outubro de 2020 após um ciclo de preparação endometrial artificial usando valerato de estradiol e P4 vaginal micronizado (400 mg duas vezes ao dia). Sempre que o valor de P4 sérico estava abaixo de 10 ng/mL na manhã da transferência planejada, adicionou-se 10 mg de DYD tri-diário como suplementação. O desfecho primário foi gravidez evolutiva após 10 semanas. A amostra foi subdividida em dois grupos de acordo com o P4 sérico no dia da TEC: baixo (< 10 ng/mL, com suplementação de DYD) ou normal (acima de 10 ng/mL). Realizamos equações de estimativa generalizada linear ou logística (GEE), conforme apropriado. Resultados Analisaram-se 304 ciclos de FET de 241 casais, dos quais 11,8% (n = 36) tinham valores de P4 sérico abaixo de 10 ng/mL no dia da TEC. Os dados clínicos e demográficos dos pacientes eram comparáveis entre os grupos. Globalmente, 191 ciclos (62,8%) tiveram uma gravidez bioquímica, dos quais 131 (44,1%) foram gestações em curso, com uma taxa de aborto espontâneo de 29,8%. Não encontramos diferenças estatisticamente significativas na taxa de gravidez bioquímica (63 vs. 64%) ou nas taxas de gravidez evolutiva (50 vs. 43,3%) entre TEC com valores séricos de P4 baixos ou normais, mesmo após modelação com regressão logística multivariável. Conclusão Nossos resultados indicam que a suplementação com DYD 10 mg três vezes ao dia em mulheres com níveis séricos de P4 abaixo de 10 ng/mL em ciclos de TEC substituídos parecem conseguir resultados pelo menos tão bons como nos ciclos com valores superiores para taxas de gravidez em curso além de 12 semanas.

One Plus One is Better than Two: An Approach Towards a Single Blastocyst Transfer Policy for All IVF Patients / Um mais um é melhor que dois: Uma abordagem pela prática da transferência de embrião único para todos os pacientes de FIV

Abstract Objective It is known that the single embryo transfer (SET) is the best choice to reduce multiples and associated risks. The practice of cryopreserving all embryos for posterior transfer has been increasingly performed for in vitro fertilization (IVF) patients at the risk of ovarian hyperstimulation syndrome or preimplantation genetic testing for aneuploidy. However, its widespread practice is still controverse. The aim of this study was to evaluate how effective is the transfer of two sequential SET procedures compared with a double embryo transfer (DET) in freeze-only cycles. Methods This retrospective study reviewed 5,156 IVF cycles performed between 2011 and 2019, and 506 cycles using own oocytes and freeze-only policy with subsequent elective frozen-thawed embryo transfers (eFET) were selected for this study. Cycles having elective SET (eSET, n = 209) comprised our study group and as control group we included cycles performed with elective DET (eDET, n = 291). In the eSET group, 57 couples who had failed in the 1st eSET had a 2nd eFET, and the estimated cumulative ongoing pregnancy rate was calculated and compared with eDET. Results After the 1st eFET, the ongoing pregnancy rates were similar between groups (eSET: 35.4% versus eDET: 38.5%; p =0.497), but the estimated cumulative ongoing pregnancy rate after a 2nd eFET in the eSET group (eSET + SET) was significantly higher (48.8%) than in the eDET group (p < 0.001). Additionally, the eSET +SET group had a 2.7% rate of multiple gestations, which is significantly lower than the eDET group, with a 30.4% rate (p < 0.001). Conclusion Our study showed the association of freeze-only strategy with until up to two consecutive frozen-thawed eSETs resulted in higher success rates than a frozenthawed DET, while drastically reducing the rate of multiple pregnancies.

Resumo Objetivo Sabe-se que a transferência de embrião único (SET) é a melhor escolha para reduzir as gestações múltiplas e riscos associados. A prática da criopreservação de todos os embriões para transferência posterior tem sido cada vez mais utilizada para fertilização in vitro (FIV), em especial quando há risco de síndrome de hiperestimulação ovariana ou realização de teste genético pré-implantacional. Entretanto, sua utilização disseminada ainda é controversa. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de duas SET sequenciais em comparação com uma transferência de embrião dupla (DET) em ciclos de FIV onde todos os embriões foram criopreservados. Métodos Neste estudo retrospectivo foram revisados 5.156 ciclos de FIV realizados entre 2011 e 2019, e 506 ciclos usando oócitos próprios e criopreservação de todos os embriões com transferências eletivas subsequentes de embriões descongelados, foram selecionados para este estudo. Ciclos com transferência eletiva de embrião único (eSET, n = 209) compuseram nosso grupo de estudo e como grupo de controle incluímos os ciclos com transferência eletiva de dois embriões (eDET, n = 291). No grupo eSET, 57 casais que falharam na 1ª tentativa de eSET tiveram uma 2ª eFET e a taxa de gravidez em curso cumulativa foi estimada para o grupo eSET e comparada com o grupo eDET. Resultados Após a 1ª eFET, as taxas de gravidez em curso foram semelhantes entre os grupos (eSET: 35,4% versus eDET: 38,5%; p = 0,497), mas a taxa de gravidez em curso cumulativa estimada após a 2ª eFET no grupo eSET (eSET + SET) foi significativamente maior (48,8%) do que no grupo eDET (p <0,001). Além disso, as taxas de gestação múltipla foram expressivamente inferiores no grupo eSET + SET (2,7%) quando comparado ao grupo eDET (30,4%; p < 0,001). Conclusão Nosso estudo mostrou que a associação das estratégias de congelamento de todos os embriões com até duas eSETs sequenciais resultou em maiores taxas de sucesso do que uma DET com embriões descongelados, além de reduzir drasticamente a ocorrência de gestações múltiplas.

Asynchrony between in vivo and in vitro rabbit embryos

Background: Comparative features of embryos developed under in vitro and in vivo conditions are particularly important in designing embryo transfer procedures that fulfil embryo-recipient synchronization requirements. Objective: To determine the degree of asynchrony in rabbit embryo development between cultured and in vivo embryos. Methods: A total of 55 non- lactating multiparous female rabbits were used. Embryos were classified as 16-cells or early morulae at 48 hours post-coitum (hpc). Embryos were cultured during 30 or 32 h and embryo development was compared with in vivo embryos of 72 hpc. In vitro and in vivo embryos at 72 hpc were classified as early or compacted morulae. Bayesian statistics was used. Difference between in vivo and in vitro embryos and the actual probability of the difference between the in vivo and in vitro embryo higher than zero (P) was estimated. Results: The percentage of compacted morulae was higher in in vivo embryos than in in vitro embryos with +6 h of asynchrony (73.5 and 32.8%, P=1.00). But the percentage of compacted morulae was similar with +8 h asynchrony. Conclusions: In vitro embryos delay their development by + 8 hours compared to in vivo embryos.

Antecedentes: El desarrollo comparativo de embriones producidos in vitro e in vivo es particularmente importante para el diseño de procedimientos de transferencia de embriones cuando se requiere sincronización entre el embrión y la hembra receptora. Objetivo: Determinar el grado de asincronía en el desarrollo embrionario entre embriones in vivo y cultivados. Métodos: Un total de 55 conejas multiparas no lactantes fueron utilizadas. Los embriones se clasificaron en 16 células o mórulas tempranas a las 48 horas después del coito (hpc). Los embriones se cultivaron durante 30 ó 32 horas y el desarrollo embrionario se comparó con embriones de 72 hpc obtenidos in vivo. Los embriones in vitro e in vivo a 72 hpc se clasificaron como mórulas tempranas o compactas. Se utilizó estadística bayesiana. Se estimó la diferencia entre embriones in vivo e in vitro y la probabilidad de que la diferencia sea superior a cero (P). Resultados: El porcentaje de mórulas compactas fue mayor en embriones in vivo que en embriones in vitro con +6 horas de asincronía (73,5 y 32,8%, P=1,00), pero el porcentaje de mórulas compactas fue similar con asincronía de +8 horas. Conclusión: Los embriones cultivados retrasan +8 horas su desarrollo en comparación con los embriones in vivo.

Antecedentes: A aquisição do desenvolvimento de embriões produzidos in vitro e in vivo é particularmente importante na concepção de procedimentos de transferência de embriões em que a sincronização entre o embrião e a fêmea receptora é necessária. Objetivo: Determinar o grau de assincronia no desenvolvimento embrionário entre embriões cultivados e in vivo. Métodos: Um total de 55 coelhos multíparos não lactantes foram usados. Os embriões foram classificados em 16 células ou mórulas iniciais 48 horas de gestação (hpc). Os embriões foram cultivados por 30 ou 32 horas e o desenvolvimento embrionário foi comparado com embriões de 72 hpc obtidos in vivo. Embriões in vitro e in vivo a 72 hpc foram classificados como mórulas precoces ou compactadas. Estatísticas bayesianas foram usadas. A diferença entre embriões in vivo e in vitro e a probabilidade de que a diferença seja maior que zero (P) foi estimada. Resultados: A porcentagem de mórulas compactadas foi maior em embriões in vivo do que em embriões in vitro com +6 horas de assincronia (73,5 e 32,8%, P=1,00). Mas a porcentagem de mórulas compactadas foi semelhante com assincronia de +8 horas. Conclusão: Embriões cultivados atrasam seu desenvolvimento em +8 horas em comparação com embriões in vivo.

Well-of-the-well (WOW) versus polyester mesh (PM): a comparison of single-embryo culture systems in bovines

Background: Mexico is innovating in the livestock industry through in vitro generation of bovine embryos with technologies such as well-of-the-well (WOW) and polyester mesh (PM) single-embryo culture systems. These techniques allow to maintain embryos in separate areas of a shared culture medium. Objective: To compare the quantity and quality of bovine embryos produced in WOW and PM culture systems versus the conventional (CG) culture system. Methods: In total, 345 embryos fertilized in vitro were evaluated for blastocyst yield in the three culture systems. To count blastocyst cell numbers, 69 embryos in each system were differentially stained for trophectoderm (TE), inner cell mass (ICM), and apoptotic cells. A qPCR gene expression analysis was performed for embryos in all three systems. Results: The WOW, PM and CG systems developed similar amount of blastocysts (41, 35 and 36%, respectively; p>0.05). Blastocysts in all three systems showed adequate amounts of ICM and apoptotic cells. Blastocysts in the PM system showed a greater number of TE cells [63.7 versus 58.6% in the CG system (p0.05). The ATP5B expression was higher in WOW than in PM (p0.05). The TJP3 expression was higher in PM than in WOW and CG (p<0.05). Expression of ID2 and CLDN4 was higher in WOW than in PM and CG (p<0.05). The biplot graphic from Principal Component Analysis (PCA) revealed that CG was located near degenerated embryos, whereas PM was located near arrested embryos, larger ICM and TE, and TJP3 expression. The WOW was located toward blastocysts, morulae, and expression of CLDN4, ID2 and GNAS. Conclusion: Compared with CG, both the PM and WOW systems are good options for culturing single embryos in the bovine model. Moreover, the PCA results suggest that embryos developed in the WOW system have greater capacity for generating blastocysts with increased ability to form TE and ICM layers, which might improve implantation.

Antecedentes: México está innovando en la industria ganadera a través de la generación in vitro de embriones bovinos con tecnologías de cultivo individual como lo son Pozo dentro de Pozo (WOW) y Malla de Poliéster (PM). Estos mantienen los embriones en áreas separadas mientras comparten un mismo medio de cultivo celular. Objetivo: Comparar la cantidad y calidad de embriones bovinos producidos en los sistemas WOW y PM contra el sistema de cultivo convencional en grupo (CG). Métodos: En total se evaluaron 345 embriones fertilizados in vitro para determinar la producción de blastocistos generados en los tres sistemas. Para contar el número de células por blastocisto, 69 embriones en cada sistema se tiñeron diferencialmente para trofectodermo (TE), masa celular interna (ICM) y células apoptóticas. Se realizó un análisis de expresión génica por qPCR de los embriones obtenidos en los tres sistemas. Resultados: Los sistemas WOW, PM y CG desarrollaron similares cantidades de blastocistos (41, 35 y 36%, respectivamente; p>0,05). Los blastocistos en los tres sistemas mostraron cantidades adecuadas de ICM y células apoptóticas. Los blastocistos en el sistema PM mostraron un mayor número de células TE [63,7% versus 58,6% en el sistema CG (p0,05). La expresión de ATP5B fue mayor en WOW que en PM (p<0,05), pero similar a CG (p<0,05). La expresión de TJP3 fue mayor en PM que en WOW y CG (p<0,05). La expresión de ID2 y CLDN4 fue mayor en WOW que en PM y CG (p<0,05). El gráfico de biplot del análisis de componentes principales reveló que CG se encontró cerca de embriones degenerados, mientras que PM se encontró cerca de embriones en arresto, ICM, TE, y TJP3. El WOW se localizó hacia blastocistos, mórulas y la expresión de CLDN4, ID2 y GNAS. Conclusión: En el modelo bovino los sistemas PM y WOW son buenas opciones para cultivar embriones individuales, ya que se obtienen resultados muy similares a los obtenidos con el sistema CG. Además, los resultados de PCA sugieren que los embriones individuales desarrollados en el sistema WOW generan blastocistos con mayor capacidad de formar TE e ICM, lo que podría mejorar su éxito de implantación.

Antecedentes: O México está inovando na indústria pecuária por meio da geração in vitro de embriões bovinos com tecnologias de cultura de embriões individuais, bem como em poço (WOW) e malha de poliéster (PM). Estes mantêm os embriões em áreas separadas, enquanto compartilham o mesmo meio de cultura de células. Objetivo: Comparar a quantidade e a qualidade de embriões bovinos produzidos nos sistemas de cultura WOW e PM com o sistema convencional de cultura em grupo (CG). Métodos: No total, 345 embriões fertilizados in vitro foram avaliados para determinar a produção de blastocistos gerados nos três sistemas. O número de células por blatocisto foi contado, 69 embriões em cada sistema foram diferencialmente corados para trofectoderme (TE), massa celular interna (ICM) e células apoptóticas. Uma análise de expressão gênica qPCR foi realizada para os embriões obtidos nos três sistemas. Resultados: Os sistemas WOW, PM e CG desenvolveram quantidades semelhantes de blastocistos (41, 35 e 36%, respectivamente; p>0,05). Os blastocistos nos três sistemas mostraram quantidades adequadas de ICM e células apoptóticas. Os blastocistos no sistema PM mostraram um número maior de células TE [63,7 versus 58,6% no sistema CG (p0,05). A expressão de ATP5B foi maior no WOW do que no PM (p<0,05), mas semelhante ao GC (p<0,05). A expressão de TJP3 foi maior no PM do que no WOW e CG (p<0,05). A expressão de ID2 e CLDN4 foi maior no WOW do que no PM e CG (p<0,05). O gráfico biplot da análise de componentes principais revelou que CG foi encontrado próximo a embriões degenerados, enquanto PM foi encontrado próximo a embriões presos, ICM, TE e TJP3. WOW foi encontrado para ter blastocistos, mórulas e a expressão de CLDN4, ID2 e GNAS. Conclusão: Em comparação com o CG, os sistemas PM e WOW são boas opções para a cultura de embriões individuais no modelo bovino. Além disso, os resultados da PCA sugerem que embriões individuais desenvolvidos no sistema WOW têm maior capacidade de desenvolver blastocistos com maior capacidade de formar as camadas TE e ICM, o que poderia melhorar seu sucesso de implantação.

Morphometry of bovine blastocysts produced in vitro in culture media with antioxidants cysteamine or oily extract of Lippia origanoides / [Morfometria de blastocistos bovinos produzidos in vitro em meio de cultura com antioxidantes cisteamina ou extrato oleoso de Lippia origanoides]

This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50µM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5µg/mL, 5.0µg/mL or 10.0µg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.(AU)

Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50µM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5µg/mL, 5,0µg/mL ou 10,0µg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.(AU)

Lentivirus vectors fail to deliver transgenes into bovine zygotes after co-incubation with sperm during in vitro fertilization / [Lentivírus falham na entrega de transgenes em zigotos bovinos após coincubação com espermatozoide, durante fertilização in vitro]

As vantagens dos animais transgênicos têm sido demonstradas em diferentes aplicações, entretanto muitas metodologias usadas para gerar animais geneticamente modificados (GM) apresentam baixas taxas de eficiência. O objetivo deste estudo foi avaliar a entrega dos vetores lentivirais (VLs) em zigotos durante a fertilização in vitro (FIV), para gerar embriões GM, com o gene da proteína verde fluorescente (GFP) ou do fator IX de coagulação humana (FIX). Vetores lentivirais com os genes GFP (pLGW-GFP-LV) ou FIX (pLWE2-FIX-LV) foram utilizados na FIV ou na cultura de embriões in vitro (CIV). A coincubação de pLWE2-FIX-LV com espermatozoides e complexos oócitos-células do cumulus (COCs) durante a FIV diminuiu (P<0,05) as taxas de clivagem e de blastocistos, enquanto com pLGW-GFP-LV diminuiu (P<0,05) a taxa de blastocisto quando se comparou ao controle sem VL. A coincubação de pLWE2-FIX-LV e pLGW-GFP-LV com presumíveis zigotos durante a CIV não afetou (P>0,05) o desenvolvimento embrionário. A expressão da proteína GFP não foi detectada em embriões após a coincubação de FIV ou CIV, embora as células do cumulus expressassem a proteína até o dia oito de cultivo in vitro. Reações em cadeia da polimerase (PCR) não detectaram os genes GFP ou FIX em embriões, mas ambos foram detectados em células do cumulus. Assim, a coincubação de VL com espermatozoide bovino e COCs não é eficaz para produzir embriões geneticamente modificados por meio de FIV.(AU)

Influence of different protein supplements on the recovery and in vitro maturation of bovine oocytes / Influencia de diferentes suplementos proteicos en la recuperación y maduración in vitro de ovocitos bovinos / Influência de diferentes suplementações proteicas sobre a recuperação e maturação in vitro de oócitos bovinos

Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.

Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.

Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.

Quantificação do DNA e genotipagem de biópsias de embriões bovinos Gir e Girolando produzidos in vitro / DNA quantification and genotyping of biopsies obtained from Gyr and Girolando in vitro produced bovine embryos

A biópsia embrionária associada à genotipagem permite a obtenção de informações genômicas antes mesmo da transferência dos embriões. Neste estudo, foram avaliadas amostras biopsiadas de blastocistos bovinos transferidos para receptoras (n=47), sob a hipótese de que a raça (Gir ou Girolando), o estádio embrionário (blastocisto ou blastocisto expandido) e a competência para estabelecimento de prenhez (positiva ou negativa) afetariam a quantidade e a qualidade do DNA da amostra obtida. O DNA foi extraído, amplificado, quantificado por eletroferograma e genotipado. O parâmetro call rate (CR) foi adotado para mensurar a qualidade da genotipagem. Obteve-se concentração de DNA de 86,07±171,66ng/µL e CR 0,73±0,17. O CR não variou em função da quantidade de DNA nas amostras. As variáveis raça e estádio embrionário não influenciaram a concentração de DNA, nem o CR. Houve efeito da prenhez sobre o CR (P=0,0187), mas, como houve maior CR nas amostras provenientes do grupo prenhez negativa, não foi possível associar esse parâmetro à qualidade embrionária. Concluiu-se que a raça e a qualidade embrionária não afetam os parâmetros aqui estudados em amostras embrionárias, ou seja, embriões com maiores chances de implantação não refletem alta qualidade nas amostras de biópsia genotipadas.(AU)

Embryo biopsy associated with genotyping allows genomic information before embryo transfer. In this study, blastocyst biopsy samples from embryos transferred to recipients (n= 47) were evaluated, under the hypothesis that breed (Gyr or Girolando), embryonic stage (blastocyst or expanded blastocyst) and competence to establish pregnancy (positive or negative) would affect the quantity and DNA quality of samples. DNA was extracted, amplified, quantified by electropherogram and genotyped. The parameter call rate (CR) was used to measure the quality of genotyping. DNA concentration of 86.07±171.66ng/µl, and CR 0.73±0.17 was obtained. CR did not vary according to the amount of DNA in the samples. The variables breed and embryonic stage had no influence on DNA concentration or CR. There was pregnancy effect on the CR (P= 0.0187), but since there was a higher CR in the samples from the negative pregnancy group, it was not possible to associate this parameter with the embryonic quality. We conclude that the breed and embryo quality do not affect the evaluated parameters in embryonic samples. Embryos with higher chances of implantation do not reflect high quality in embryo biopsy genotyped samples.(AU)

Efficacy and limitations of different approaches to anticipate the diagnosis of pregnancy in cattle / Eficácia e limitações de diferentes abordagens para antecipar o diagnóstico de gestação em bovinos

The study evaluated sonographic and serologic exams performed for early (20 to 30d) diagnosis of pregnancy. One hundred-twenty (n= 120) bovine recipients were synchronized (estrous=D0) and timed embryo transferred (TET, D7) with fresh in vitro produced embryos. In the first trial (n= 46), diagnosis of pregnancy was performed on day 20 (D20) by detecting CL blood flow (BF) and by Pregnancy-Associated Glycoproteins (PAGs) serology. In the second trial (n= 30), pregnancy diagnosis was performed on D25 by ultrasound visualization of uterine contents and by PAGs serology. In the last trial, PAG's serology was performed on D30. Ultrasonographic detection of the uterine contents and embryo viability performed on D30 (DG30) was considered the gold standard. The PROC FREQ procedure was used to test the agreement between diagnostic methods. On D20, the Doppler ultrasonography of the CL had showed high sensitivity (100%), but only moderate specificity (53.3%). On the same day, serologic diagnostic had no agreement (k= -0.08, P< 0.46) with the gold standard, with very low sensitivity (6.3%). However, the sensitivity of the serologic exam increased dramatically (from 6.3 to 100%) from D20 to D25, and it contributed to detect false negatives from the ultrasound diagnosis, improving the overall accuracy from 90% to 96.7%.(AU)

O estudo foi planejado para correlacionar exames ultrassonográficos e sorológicos realizados para o diagnóstico precoce (20 a 30d) de gestação. Cento e vinte (n= 120) receptoras bovinas foram sincronizadas (estro=D0), e embriões frescos produzidos in vitro foram transferidos em tempo fixo (TETF, D7). No experimento 1 (n= 46), o diagnóstico de gestação foi realizado no D20, pela detecção do fluxo sanguíneo do CL e pela sorologia de glicoproteínas associadas à gestação (PAGs). No experimento 2 (n= 30), a detecção da gestação foi realizada por meio da visualização do conteúdo do útero e também pela sorologia para PAGs. No experimento 3, a sorologia para PAGs foi realizada no D30. Em todos os experimentos, a visualização ultrassonográfica da vesícula e da viabilidade embrionária, realizada no D30, foi considerada padrão-ouro. O procedimento PROC FREQ testou o nível de concordância dos métodos diagnósticos. No D20, o diagnóstico baseado na vascularização do CL mostrou alta sensibilidade (100%) e apenas moderada especificidade (53,3%). Nesse mesmo dia, o diagnóstico sorológico não apresentou concordância (k=-0,08, P<0,46) com o padrão-ouro, além de baixa sensibilidade (6,3%). No entanto, a sensibilidade do exame sorológico aumentou drasticamente (6,3 para 100%) do D20 para o D25, contribuindo para detectar falsos negativos diagnosticados pela ultrassonografia, melhorando a acurácia (90 para 96,7%).(AU)

Evaluation of embryo collection and transfer days on pregnancy rate of Mangalarga Marchador mares during the breeding season / Evaluación de los días de recolección y transferencia de embriones sobre las tasas de preñez en yeguas Mangalarga Marchador durante la estación de monta / Avaliação do dia da colheita e da transferência de embriões equino da raça Mangalarga Marchador durante a estação de monta

Abstract Background: Proper timing for embryo collection and transfer in horses -which is critical for the success of this biotechnology- is still debated. Additionally, there is little information on this technology under tropical conditions. Objective: To determine the best day for collection and transfer of embryos in Mangalarga Marchador mares under Brazilian northeast's conditions. Methods: Donors (n= 30) and recipients (n= 76) in diestrus phase were selected based on both clinical and gynecology examinations. Estrus was induced on both donor and recipient mares by intramuscular injection of 5 mg Dinoprost, aiming to obtain an ovulation interval of -1 to +3 between recipient and donor. Ovulation was induced with buserelin acetate when the largest follicle reached at least 35 mm in diameter. At this time, mares were subjected to artificial insemination at 48-hour intervals until ovulation. The embryos were collected on days 7, 8, and 9 after ovulation. Results: The embryo collection on day 8 was more efficient (p<0.05) than on day 7, but it was not more effective (p>0.05) than day 9, which presented the same efficiency (p>0.05) as day 7. From a total of 76 embryos transferred to the recipients, that were between days 4 and 9 after ovulation, there was no influence (p>0.05) of the day of transfer on pregnancy rate. Conclusions: The embryo collection must be performed on day 8 after ovulation, and transfer can be performed on any day of that interval (4-9) without affecting the pregnancy rate.

Resumen Antecedentes: El momento mas apropiado para la recolección y transferencia de embriones en equinos -que es fundamental para el éxito de esta biotecnología- continua siendo sujeto de estudio. Además, es escasa la información sobre esta tecnología en condiciones tropicales. Objetivo: Determinar el momento mas adecuado para la recolecta y transferencia de embriones en yeguas Mangalarga Marchador, en las condiciones del nordeste Brasileño. Métodos: Donadoras (n= 30) y receptoras (n= 76) en la fase de diestro se seleccionaron con base en los exámenes clínicos y ginecológicos. El estro de las yeguas donadoras y receptoras fue inducido con 5 mg de Dinoprost, vía intramuscular, intentando obtener un intervalo de ovulación de -1 a +3 entre la receptora y la donadora. La ovulación fue inducida con acetato de buserelina cuando el folículo mayor alcanzó 35 mm de diámetro. En ese momento, las yeguas fueron sometidas a inseminación artificial en intervalos de 48 horas hasta la ovulación. Los embriones fueron recolectados en los días 7, 8 y 9 después de la ovulación. Resultados: La recolecta de embriones en el día 8 fue más eficiente (p<0,05) que en el día 7, pero no fue más efectivo (p>0,05) que en el día 9, el cuál presentó la misma eficiencia (p>0,05) que en el día 7. De un total de 76 embriones transferidos a las receptoras, que se encontraban entre el día 4 y 9 después de la ovulación, no se registró influencia (p>0,05) del día de la transferencia en la tasa de preñez. Conclusiones: La recolecta embrionaria debe ser realizada el día 8 después de la ovulación, y la transferencia puede ser realizada en cualquier día de este intervalo (4 a 9) sin que se afecte la tasa de preñez.

Resumo Antecedentes: A importância do momentoda colheita e da transferência do embrião equino para o sucesso dessa biotécnica em equino continua sem ser completamente entendida. Adicionalmente, existe pouca informação sobre essa tecnologia em condições tropicais. Objetivo: Determinar o melhor dia para colheita e para transferência de embriões em eguas manga larga marchador nas condições do nordeste brasileiro. Métodos: Doadoras (n = 30) e receptoras (n = 76) na fase de diestro foram selecionadas com base nos exames clínico e ginecológicos. O estro das éguas doadoras e receptoras foi induzido com 5 mg de Dinoprost administrado por via intramuscular, buscando obter um intervalo de ovulação de -1 a +3 entre a receptora e a doadora. A ovulação foi induzida com acetato de buserelina quando o foliculo maior alcançou o tamanho de 35 mm de diâmetro. Nesse momento, as éguas foram submetidas a inseminação artificial em intervalos de 48 horas até a ovulação. Os embriões foram colhidos nos dias 7, 8 e 9 depois da ovulação. Resultados: A colheita de embriões no dia 8 foi mais eficiente (p<0,05) do que no dia 7, porem não foi mais efetivo (p>0,05) do que o dia 9, o qual apresentou a mesma eficiência (p>0,05) que o dia 7. De um total de 76 embriões transferidos para as receptoras que se encontravam entre os dias 4 e 9 depois da ovulação, não se registrou influência (p>0,05) do dia da transferência sobre a taxa de prenhez. Conclusões: A colheita embrionária deve ser realizada no dia 8 depois da ovulação, e a transferência pode ser realizada em qualquer dia desse intervalo (4-9) sem que a taxa de prenhez seja afetada.

Antioxidant activity of oily extract obtained from Lippia origanoides improves the quality of bovine embryos produced in vitro / Atividade antioxidante de óleo essencial obtido de Lippia origanoides melhora a qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro

The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50µM/mL Cysteamine; T3)2.5µg/mL; T4)5.0µg/mL and T5)10.0µg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.(AU)

O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50µM/mL Cisteamina; T3) 2,5µg/mL; T4) 5,0µg/mL e T5) 10,0µg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.(AU)

Pregnancy and delivery rates after vitrification of in vitro -produced Nelore ( Bos indicus ) embryos under field conditions / Tasas de preñez y nacimientos después de la vitrificación de embriones Nelore (Bos indicus) producidos in vitro bajo condiciones de campo / Taxas de prenhez e nascimentos após vitrificação de embriões Nelore (Bos indicus) produzidos in vitro sob condições de campo

Abstract Background: Cryopreservation preserves cellular viability under low temperatures, resulting in diminished intracellular enzymatic activity and reduced cellular metabolism that ultimately allows preserving genetic material for indefinite periods of time. Embryos submitted to cryopreservation suffer from considerable morphological and functional damage, resulting in reduced survival and development rates. Objective: To evaluate pregnancy and delivery rates of in vitro-produced (IVP) Nellore (Bos indicus) embryos after vitrification under field conditions. Methods: The IVP embryos at blastocyst (Bl) and expanded blastocyst (Bx) were transferred fresh (n= 137) or after vitrification (n= 127). Results: Pregnancy rates at 35 d for fresh embryos were lower in Bl (41.6) than in Bx (60.9) (p<0.05). After vitrification, pregnancy rates were similar at 35 d between Bl (38.0) and Bx (47.6) (p>0.05). Pregnancy loss at 60 d were similar (p>0.05) for both fresh (Bl: 3.1 and Bx: 4.8) and vitrified embryos (Bl: 1.9 and Bx: 4.7). Delivery rates were similar between groups (p>0.05). Conclusion: Both pregnancy and delivery rates of Bos indicus IVP embryos vitrified under field conditions are indistinguishable from fresh embryos.

Resumen Antecedentes: La criopreservación se caracteriza por el mantenimiento de la viabilidad celular a bajas temperaturas, resultando en reducido metabolismo y actividad enzimática intracelular, lo que permite la preservación del material genético por períodos de tiempo indefinidos. Los embriones sometidos a ésta técnica sufren daños morfológicos y funcionales considerables, dando como resultado una sobrevivencia y tasas de desarrollo reducidas. Objetivo: Evaluar la tasa de preñez a partir de embriones Nelore (Bos indicus) producidos in vitro (IVP) después de la vitrificación bajo condiciones de campo. Métodos: Embriones IVP en los estadios de blastocisto (Bl) y blastocisto expandido (Bx) se transfirieron en fresco (n= 137) o después de la vitrificación (n= 127). Resultados: La tasa de preñez a los 35 d fue menor para los embriones transferidos en fresco en fase Bl (41,6) en relación con los Bx (60,9) (p<0,05). Después de la vitrificación, las tasas de preñez a los 35 d fueron similares entre Bl (38,0) y Bx (47,6) (p>0,05). Las pérdidas de preñez a los 60 d fueron similares (p>0,05) tanto para embriones en fresco en Bl (3,1) y Bx (4,8) como para los vitrificados (Bl: 1,9 y Bx: 4,7). Las tasas de nacimiento fueron similares entre los grupos (p>0,05). Conclusión: Las tasas de preñez y nacimiento de embriones IVP vitrificados de Nelore (Bos indicus) bajo condiciones de campo son semejantes a las de embriones en fresco.

Resumo Antecedentes: A criopreservação é caracterizada pela manutenção da viabilidade celular em baixas temperaturas, resultando em atividade enzimática intracelular e metabolismo celular reduzido, que permite a preservação do material genético por períodos indefinidos de tempo. Embriões submetidos à criopreservação sofrem danos morfológicos e funcionais consideráveis, resultando em sobrevivência reduzida e menores taxas de desenvolvimento. Objetivo: Avaliar a taxa de prenhez a partir de embriões Nelore (Bos indicus) produzidos in vitro (IVP) após a vitrificação sob condições de campo. Métodos: Embriões IVP nos estádios de blastocisto (Bl) e blastocisto expandido (Bx) foram transferidos a fresco (n= 137) ou depois da vitrificação (n= 127). Resultados: A taxa de prenhez aos 35 d foi menor para os embriões transferidos a fresco na fase de Bl (41,6), em relação aos Bx (60,9) (p<0,05). Apos a vitrificação, as taxas de prenhez foram semelhantes aos 35 d entre Bl (38,0) e Bx (47,6) (p>0,05). As perdas de prenhez aos 60 d foram semelhantes (p>0,05) tanto para embriões a fresco nos estádios de Bl (3,1) e Bx (4,8), e vitrificados em Bl (1,9) e Bx (4,7). As taxas de nascimentos foram semelhantes entre os grupos (p>0,05). Conclusão: As taxas de prenhez e nascimentos dos embriões IVP vitrificados de Nelore (Bos indicus) sob condições de campo é semelhante àquela dos embriões a fresco.

Decontamination of genetically modified mice strains by embryo transfer for obtaining SPF colonies in a Brazilian animal facility / Descontaminação de linhagens de camundongos geneticamente modificadas por transferência embrionária para obtenção de colônias SPF em um biotério brasileiro (São Paulo, SP)

The introduction of new strains of mice in specific pathogen-free (SPF) animal facilities should be performed carefully to avoid breaking sanitary barriers. To meet this need, animals should be rederived to reduce infection risk and thus avoid research interference caused by loss of animal health status and welfare. The objective of this study was to implement mice embryo transfer in the laboratory mouse facility of the Department of Immunology at the Institute of Biomedical Sciences/University of São Paulo, Brazil. Embryo transfers were performed to rederive genetically modified mouse strains with undefined sanitary status, received from different research and educational institutions. Fertilized eggs at two-cell stage were obtained by natural means and transferred into the oviducts of SPF pseudo-pregnant female mice. All surgical procedures were performed under aseptic conditions. A total of 625 embryos were transferred into the recipients. 148 pups were born, of which 140 were reared. Viruses, bacteria and intestinal protozoa were eliminated using this technique. The improvement in the microbiological status of mice allowed their expansion in our SPF facility. With these results, we can stimulate the use of embryo transfer technique between rodent facilities in Brazil and thus encourage the distribution of better models to our scientific community.(AU)

A introdução de novas linhagens de camundongos em biotérios livres de patógenos específicos (SPF) deve ser realizada com critérios para evitar a quebra das barreiras sanitárias. Dessa forma, os animais devem ser rederivados para reduzir os riscos de infecção e evitar as interferências provocadas pela perda do status sanitário e do bem-estar dos animais. O objetivo deste estudo foi implementar a transferência de embriões murinos no Biotério do Departamento de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, Brasil. As transferências embrionárias foram realizadas para rederivar linhagens de camundongos geneticamente modificadas com status sanitário não conhecido, recebidas de diferentes instituições de pesquisa e de ensino. Os embriões em duas células foram obtidos pelos métodos naturais e transferidos para os ovidutos de fêmeas de camundongos SPF pseudoprenhas. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições assépticas. Um total de 625 embriões foram transferidos para as receptoras. Foram obtidos 148 filhotes nascidos vivos, destes 140 foram desmamados. Por meio desta técnica, foram eliminados vírus, bactérias e protozoários intestinais. A melhora no status microbiológico dos camundongos permitiu a expansão destes em nossa colônia SPF. Com esses resultados, podemos promover o uso da técnica de transferência de embriões entre os biotérios brasileiros e assim incentivar a distribuição de modelos mais adequados para a nossa comunidade científica.(AU)

Ethical problems with the preimplantation genetic diagnosis of human embryos / Problemas éticos con el diagnóstico genético preimplantacional de embriones humanos / Problemas éticos com diagnóstico pré-implantacional de embriões humanos

Abstract: 14. The purpose of preimplantation genetic diagnosis by embryonary biopsy is to identify genetic alterations prior to the implantation of embryos produced by in vitro fertilization. The most important aim is the selection of genetically healthy embryos due to their genetic indemnity, but it can also be used to select the sex or, eventually, other detectable traits accrding to the wishes of the parents. This procedure has been the subject of scientific debates, in relation to the harm that it can cause to healthy embryos that are going to be implanted, and in relation to the interpretation of the genetic tests made. Ethical debates have also focused on the production of and respect for the life and the integrity of developing human beings. In this work, it is argued that most of the uses of PGD are morally reprehensible, because they are done with disregard to the dignity that should be granted to embryos as human persons.

Resumen: 18. El diagnóstico genético preimplantacional (DGP) mediante biopsia embrionaria tiene como objeto la detección de alteraciones genéticas previamente a la implantación de embriones producidos por fertilización in vitro (FIV). Su finalidad más significativa es la selección de embriones por su indemnidad genética. También se puede emplear para seleccionar el sexo o eventualmente otras características detectadas según el deseo de los padres. Este procedimiento ha sido objeto de debates en el ámbito científico, por el eventual daño que puede ocasionar la técnica en embriones sanos que serán implantados y por las interpretaciones de los exámenes genéticos realizados. También ha sido objeto de debates en el ámbito ético-antropológico, en cuanto a la producción y al respeto a la vida e integridad de los seres humanos en desarrollo. En este trabajo se argumenta que los usos que se hacen del DGP son, en su gran mayoría, moralmente reprochables, por hacerse con desprecio de la dignidad que debe darse al embrión como persona humana.

Resumo: 22. O Diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) por meio de biópsia embrionária visa a identificação de alterações genéticas prévias à implantação de embriões produzidos por fertilização in vitro (FIV). Seu propósito mais significativo é a seleção de embriões por sua característica genética. Ele também pode ser usado para selecionar o sexo ou, eventualmente, outras características identificadas de acordo com os desejos dos pais. Este procedimento tem sido tema de debate em âmbito científico, por eventual dano que pode ocaciosionar a técnica em embriões saudáveis que serão implantados e pela interpretações dos exames genéricos realizados. Ele também tem sido objeto de debate na área ético-antropológica, no que concerne a produção e o respeito à vida e integridade do ser humano em desenvolvimento. Este artigo argumenta que os usos que são feitos do PGD são, em sua grande maioria, moralmente condenáveis, por ser instrumentalizado com desrespeito pela dignidade que deve ser dada ao embrião como uma pessoa humana.

Effects of glutathione supplementation and carbon source duringsomatic embryogenesis of Acca sellowiana (O. Berg) Burret(Myrtaceae) / Efeitos da suplementação de glutationa e fontes de carbono durante a embriogênesesomática de Acca sellowiana (O. Berg) Burret (Myrtaceae)

The present study intended to investigate the effects of different glutathione (GSH) levels (0, 0.1, 0.5 and 1 mM) on the somatic embryogenesis (SE) induction of Acca sellowiana. Besides, we evaluated the effect of different carbon sources (sucrose and maltose) on the somatic embryos conversion. GSH-supplemented treatments resulted in improved SE induction rates (~70%) as compared to the control GSH-free (~35%) after 50 days of culture. The total number of somatic embryos obtained did not differ between treatments, but significant differences were observed for the embryonic stages after 80 days of culture. After 80 days of culture, 0.5 and 1 mM GSH-supplemented treatments showed the largest amount of torpedo-staged somatic embryos. In contrast, treatments supplemented with 0 and 0.1 mM GSH showed equal amounts of somatic embryos at all embryonic stages. These results indicate that GSH accelerates the SE induction process and increases the synchrony of the somatic embryo formation of A. sellowiana. The use of maltose for the somatic embryos conversion, as compared to sucrose, did not influence the conversion rate of normal chlorophyllous somatic embryos, but increased the formation of normal achlorophyllous somatic plantlets. This finding can be attributed to the rapid hydrolysis of sucrose, contributing to an enhanced chlorophyll synthesis.

O presente estudo teve como objetivo investigar o efeito de diferentes níveis de glutationa (GSH) (0, 0,1, 0,5 e 1 mM) na indução da embriogênese somática (ES) de Acca sellowiana. Além disso, avaliamos o efeito de diferentes fontes de carbono (sacarose e maltose) na conversão de embriões somáticos em plântulas. Os tratamentos suplementados com GSH resultaram em melhores taxas de indução de ES (~70%) em comparação com o controle isento de GSH (~35%) após 50 dias de cultivo. Após 80 dias as taxas de indução foram iguais. O número total de embriões somáticos obtidos não diferiu entre os tratamentos, mas diferenças expressivas foram observadas nos estágios embrionários. No dia 80 em cultura, os tratamentos suplementados com 0,5 e 1 mM de GSH mostraram a maior porção de embriões somáticos no estádio torpedo. Diferentemente, tratamentos suplementados com 0 e 0,1 mM de GSH mostraram quantidades iguais de embriões somáticos em todos os estágios embrionários. Estes resultados indicam que o GSH acelera o processo de indução do ES e aumenta a sincronia na formação de embriões somáticos de A. sellowiana. O uso de maltose no meio de cultura de conversão de embriões somáticos, em comparação com a sacarose, não influenciou a taxa de conversão de embriões somáticos clorofílados normais, mas aumentou a formação de plântulas aclorofiladas normais. Esse resultado pode ser atribuído à rápida hidrólise da sacarose, apresentando translocação de plantas mais eficiente e aumento da osmolaridade do meio de cultura, contribuindo para uma síntese melhorada de clorofila.

Freezing goat embryos at different developmental stages and quality using ethylene glycol and a slow cooling rate / Congelação de embriões caprinos em diferentes estádios de desenvolvimento e qualidade utilizando etileno glicol e taxa de resfriamento lenta

The efficiency of an alternative freezing protocol for goat embryos of different morphology and quality was tested. Fifty-eight embryos on Day 6-7 stage were transferred as fresh or after freeze-thawing (n=29/group). For freezing, embryos were placed into 1.5M ethylene-glycol solution for 10min. During this time, they were loaded in the central part of 0.25mL straw, separated by air bubble from columns containing PBS/BSA 0.4% plus 20% BFS. Straws were then frozen using a freezing machine from 20ºC to -6ºC at a cooling rate of 3ºC/min, stabilization for 15min (seeding after 5min), from -6 C to -32ºC at 0.6 C/min,and plunged into liquid nitrogen. Frozen embryos were thawed for 30s at 37ºC in a water bath. Embryos subjected to fresh transfer were maintained in holding medium (37ºC). Fresh and frozen-thawed embryos were transferred at day 7 post-estrus to 30 recipients. Kidding and kid born rates were similar (P> 0.05), respectively, for recipients receiving fresh (66.7% or 10/15; 55.2% or 16/29) or frozen-thawed (60% or 9/15; 51.7% or 15/29) embryos. The cryopreservation of goat embryos using slow-freezing protocol and 1.5MEG resulted in similar efficiency rates of fresh embryos.(AU)

Este estudo testou a eficiência de protocolo alternativo de criopreservação de embriões caprinos de diferentes qualidades morfológicas. Foram utilizados 58 embriões, coletados entre o sexto e o sétimo dia do ciclo estral (n=29/grupo). Embriões congelados passaram por solução 1,5M etilenoglicol por 10min e foram aspirados durante esse tempo para parte central de palheta 0,25mL, separada por bolhas de ar de colunas contendo PBS 0,4% BSA e 20% SFB. As palhetas foram congeladas em máquina de congelação de 20ºC a -6ºC, com taxa de resfriamento de 3ºC/min, estabilização por 15min (seeding após 5min), -6ºC a -32ºC a 0,6ºC/min, e imersas em nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 30s a 37ºC, em água. Embriões frescos foram mantidos em solução de manutenção (37ºC). Embriões frescos e congelados/descongelados foram transferidos para 30 receptoras no sétimo dia do ciclo estral. A taxa de partos e a de crias nascidas (respectivamente) foram similares (P>0,05) para receptoras recebendo embriões frescos (66,7% ou 10/15; 55,2% ou 16/29) ou congelados/descongelados (60,0% ou 9/15; 51,7% ou 15/29). O protocolo de criopreservação de embriões utilizado no presente estudo resultou em índices de eficiência semelhantes aos de embriões frescos.(AU)

2- Isopentenyladenine in the induction of direct somatic embryogenesis capacity of Coffea arabica L / 2- Isopenteniladenina na capacidade de indução da embriogênese somática direta de Coffea arabica L

ABSTRACT: This study evaluated the effect of different concentrations of 2-isopentenyladenine (2-iP) on the direct somatic embryogenesis capacity of the Mundo Novo cultivar of Coffea arabica. Leaf explants were cultivated with half the MS salt concentration and the addition of sucrose (20gL-1) and 2-iP (0; 2.5; 5; 7.5 and 10µM). The 2-iP doses of 7.5 and 10µM produced the greatest responses with respect to the percentage of explants with embryogenic structures and the size of the embryogenic structures. However, the greatest production of somatic embryos occurred on the explants treated with 10µM of 2-iP, followed by 7.5µM, whereas their production was absent or reduced with 0 and 5µM, respectively.

RESUMO: Este estudo avaliou o efeito de diferentes concentrações de 2-isopentalinadenina (2-iP) na capacidade de embriogênese somática direta da cultivar Mundo Novo de Coffea arabica. Explantes foliares foram cultivados em meio com metade da concentração de sais de MS e adição de sacarose (20gL-1) e de 2-iP (0; 2,5; 5; 7,5 e 10µM). Os tratamentos com 7,5 e 10µM de 2-iP induziram respostas mais elevadas de porcentagem de explantes com estruturas embriogênicas e de tamanho de estrutura embriogênica. Porém, os explantes tratados 10µM de 2-iP tiveram maior produção de embriões somáticos, seguido de 7,5µM, enquanto nos tratamentos controle e com 5µM, as respostas foram respectivamente de ausência e de baixa formação destes.

Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação / Effect of conjugated linoleic acid addition in in vitro culture medium in F1 Holstein X Zebu embryo survival post vitrification

Avaliou-se o efeito da adição do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de cultivo in vitro na viabilidade pós-vitrificação de embriões F1 Holandês x Zebu. Foram utilizados três meios de cultivo: controle (n=340 oócitos): meio SOF e soro fetal bovino (SFB), sem o CLA; SFB+CLA (n=359 oócitos): meio SOF, SFB e CLA; CLA (n=339 oócitos): meio SOF e CLA, sem o SFB. Todos os blastocistos produzidos foram submetidos à vitrificação, pelo método de Open Pulled Straw. Quinze blastocistos de cada tratamento foram fixados para quantificação lipídica por coloração com Sudan Black B. Para avaliar a viabilidade embrionária, foi observada a capacidade de reexpansão e eclosão pós-aquecimento dos embriões (controle=27; SFB+CLA=30; CLA=17). Foram realizadas transferências em um ou dois embriões por receptora para avaliação da sobrevivência in vivo: T1 [receptoras que receberam um blastocisto (n=17 embriões, sendo controle=5, SFB+CLA=6 e CLA=6)]; T2 [receptoras que receberam dois blastocistos, (n= 54 embriões, sendo controle=18, SFB+CLA=14 e CLA=22)]. Não houve diferença nas taxas de clivagem (62,1%; 74,0%; 74,0% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente), produção de blastocistos em relação aos clivados (59,7%; 47,7%; 38,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) e produção de blastocistos em relação ao total de oócitos (37,1%; 35,4%; 28,3% para controle; SFB+CLA; CLA, respectivamente) (P>0,05). Houve diminuição de gotículas lipídicas nos embriões cultivados em meio suplementado com CLA em relação aos embriões cultivados na presença do SFB e na ausência do CLA (P<0,05). A taxa de reexpansão foi maior no grupo controle (70,4%) em relação ao CLA (47,1%) e menor no grupo SFB+CLA (43,3%) (P<0,05). O CLA foi eficaz em reduzir a deposição de lipídeos intracitoplasmáticos nas células embrionárias, porém não houve diferença de viabilidade após a desvitrificação dos embriões.(AU)

The effect of adding conjugated linoleic acid (CLA) to the culture media on the viability after cryopreservation of F1 Holstein X Zebu embryos was evaluated. Three different culture media were tested: control (n = 340 oocytes): SOF medium and fetal bovine serum (FBS) without the CLA; FBS + CLA (n = 359 oocytes): SOF, FBS and CLA; CLA (n = 339 oocytes): SOF and CLA without the FBS. The produced blastocysts were subjected to vitrification, by the Open Pulled Straw method. Fifteen blastocysts per treatment were fixed for lipid quantification by staining with Sudan Black B. Embryo re-expansion and hatching capability were used to assess viability (control = 27; FBS + CLA = 30; CLA = 17). Transfers of one or two embryos to recipients were performed to evaluate in vivo survival: T1 [recipients that received one blastocyst (n=17 embryos, Control=5, FBS+CLA=6 and CLA=6)]; T2 [recipients that received two blastocysts (n =54 embryos, Control=18, FBS+CLA=14 and CLA=22)]. There was no difference in cleavage rate (62.1%; 74%; 74% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively), blastocyst production in relation to the cleaved structures (59.7%; 47.7%; 38 3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) and blastocyst production relative to the total oocytes (37.1%, 35.4%, 28.3% for Control; FBS + CLA, CLA, respectively) between treatments (P> 0.05). A reduction of lipid droplets was observed in embryos cultured in medium supplemented with CLA compared to embryos cultured in the FCS in the absence and presence of CLA (P <0.05). The reexpansion rate was higher in the Control group (70.4%) compared to the CLA (47.1%) and lowest for FBS+CLA (43.3%) (P<0.05). The hatching rates were similar among treatments, 42.1%; 23.1%; 25% for control; SFB + CLA; CLA respectively (P>0.05). Only one pregnancy was observed in early and confirmatory diagnosis, as the result of a Control group embryo transfer. Although embryos cultured with CLA have shown smaller intracytoplasmic lipid content, no difference was observed in viability following vitrification between treatments.(AU)